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Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4052 (2023) Citar este artículo

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E217 es un fago de Pseudomonas utilizado en un cóctel experimental para erradicar Pseudomonas aeruginosa asociada a la fibrosis quística. Aquí, describimos la estructura de todo el virión E217 antes y después de la eyección del ADN con una resolución de 3,1 Å y 4,5 Å, respectivamente, determinada mediante microscopía electrónica criogénica (crio-EM). Identificamos y construimos estructuras de novo para 19 productos genéticos E217 únicos, resolvemos la máquina de expulsión del genoma de la cola en estados extendidos y contraídos y desciframos la arquitectura completa de la placa base formada por 66 cadenas polipeptídicas. También determinamos que E217 reconoce el antígeno O del huésped como un receptor y resolvemos la porción N-terminal de la fibra de la cola que se une al antígeno O. Proponemos que los principios de diseño de E217 presentados en este artículo se conserven en fagos Myoviridae similares a PB1 del género Pbunavirus que codifican una placa base de ~ 1,4 MDa, dramáticamente más pequeña que el colifago T4.

El bacteriófago E217 infecta a Pseudomonas aeruginosa y es parte de un cóctel de fagos experimental desarrollado para erradicar las infecciones por P. aeruginosa en larvas de Galleria mellonella (polilla de la cera) y modelos de vertebrados1,2,3. E217 es un Myoviridae similar a PB1 del género Pbunavirus caracterizado por un genoma de ~66,2 kpb1, significativamente más pequeño que el fago T4 de las enterobacterias clásicas (~169 kpb)4. Los fagos similares a PB1 son omnipresentes en la Tierra5 y se encuentran en agua dulce en los EE. UU.6 y Brasil7, así como en aguas residuales y residuales en Europa8. Estos fagos tienen genomas de ~65 kbs y complejos de placa base significativamente más simples que el colifago T4 clásico. Un único vértice quíntuple de la cápside E217 está ocupado por un aparato de cola largo y contráctil que rompe la simetría icosaédrica9. La cola se ensambla en una proteína portal dodecamérica que reemplaza una pentona de la cápside en el vértice único, proporcionando un canal de entrada y salida para que el virus empaquete y expulse el ADN10. El genoma E217 está empaquetado en una cápside precursora inmadura (o procápside) utilizando dos subunidades de terminasa, TerL y TerS que caracterizamos recientemente11. Al mismo tiempo, la placa base ensambla y recluta el tubo de la cola, las proteínas de la vaina y las fibras que se unen al vértice portal a través de un cuello formado por factores adicionales.

La mayor parte del conocimiento actual sobre el ensamblaje de Myoviridae se extrapola del sistema modelo T4, que ha sido estudiado extensamente durante más de un siglo12,13,14. En Myoviridae, la placa base es un complejo de múltiples subunidades que alberga diferentes actividades, incluida la unión a la superficie del huésped, la penetración de la membrana interna del huésped y la expulsión del genoma acoplada a la contracción. Se ha dilucidado la arquitectura de la placa base T4 aislada en los estados pre y poscontracción, aprovechando un mutante (T4-18am-23am) que ensambla todo el complejo placa base-tubo de cola pero no logra incorporarlo a un virión15. dieciséis. La placa base T4 es una máquina de ~6 MDa construida por 15 cadenas polipeptídicas diferentes repetidas en varias copias para generar un complejo molecular de ~145 proteínas. La placa base T4 tiene ~490 Å de diámetro, el doble que el ribosoma bacteriano, y contiene fibras de cola corta y larga responsables de la unión de los fagos a la pared celular bacteriana17,18. Hu et al. analizaron T4 en diversas etapas de la infección mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET)19. Curiosamente, la mayoría de las fibras de cola larga se pliegan contra el virión antes de la infección y no interactúan directamente con la superficie del huésped. El primer evento de la contracción de la cola es la unión irreversible de las fibras cortas de la cola que sobresalen de la parte inferior de la placa base a la membrana externa del huésped, lo que desencadena la contracción de la vaina. Este evento impulsa el tubo de la cola hacia el periplasma con la posterior expulsión del genoma. La perforación de la membrana del huésped no requiere la fuerza motriz del protón, que sólo es necesaria para la translocación del genoma.

Se informó un análisis crio-EM de resolución media del fago phi812 de Myoviridae similar a Twort20. Este bacteriófago contiene una placa base drásticamente diferente a la T4, con proteínas de placa base organizadas en dos capas paralelas a la pared celular bacteriana. También se encontró una placa base de doble capa similar en el fago SaGU121 de Staphylococcus aureus. Más recientemente, la estructura atómica de la piocina R2 se determinó en los estados previos y posteriores a la contracción mediante análisis de partículas individuales (SPA) crio-EM22,23,24. Las piocinas de tipo R son nanomáquinas contráctiles mínimas, similares a las colas de Myoviridae, pero que carecen de cabeza de fago e información genética. Las piocinas de tipo R comparten similitudes estructurales con los sistemas de inyección contráctil del casete de virulencia (PVC) de Photorhabdus, que, a diferencia de las piocinas, pueden apuntar a células eucariotas25. La estructura crio-EM de la piocina R2 en los estados previos y posteriores a la contracción consta de 11 factores únicos repetidos en cientos de copias, de los cuales ocho proteínas forman la placa base. La placa base de piocina R2 es mínima en comparación con el conjunto T4, pero ejerce la misma función esencial de unión al huésped y transducción de señales para iniciar la contracción de la cola y la penetración de la membrana. El trabajo con piocina sugirió que las fibras de la cola están conectadas lateralmente a la placa base y, al unirse al receptor, inician una cascada de eventos que conducen a la contracción de la vaina22. Fraser et al. elaboraron esta idea26 y encontraron que la cola contráctil tiene una energía de activación de 160 kcal/mol y desarrolla una fuerza superior a 500 pNs durante la contracción, proporcionando la energía necesaria para atravesar las membranas. Los mecanismos de contracción dilucidados para las piocinas R2 probablemente se apliquen a otros sistemas de inyección contráctiles, como los sistemas de secreción tipo VI (T6SS) y las colas de fagos27.

Más recientemente, una reconstrucción crio-EM de alta resolución del cianófago Pam3 de Myoviridae de agua dulce reveló la arquitectura de una placa base mínima de Myoviridae formada por solo seis cadenas polipeptídicas únicas28. Sorprendentemente, la placa base de Pam3 está reticulada covalentemente mediante enlaces disulfuro a doce fibras de la cola que se alternan en una configuración hacia arriba y hacia abajo. En este trabajo, describimos la estructura de alta resolución del fago E217 de Pseudomonas, que visualizamos antes y después de la contracción de la cola mediante crio-EM. Las estructuras presentadas aquí arrojan luz sobre la dinámica conformacional de un pequeño Myoviridae utilizado en un cóctel de fagos experimental, dilucidando las proteínas y los mecanismos de expulsión del genoma inducida por la contracción de la cola.

Utilizamos crio-EM SPA para visualizar la cápside icosaédrica y el aparato de cola E217 (Fig. 1a). Con el objetivo de una reconstrucción de alta resolución de la cola en los estados extendido y contraído, recopilamos dos grandes conjuntos de datos (~44.000 películas) del virión maduro E217 a pH fisiológico y básico, respectivamente (Tabla 1). A pH fisiológico, la mayoría de los viriones E217 tenían una cola extendida de aproximadamente 1500 Å de largo, con densidad de ADN dentro de la cabeza. La cola, dividida en cuello, vaina y placa base, tenía una densidad excelente para todos los componentes. Por el contrario, el pH básico desencadenó una contracción irreversible de la cola y la expulsión del genoma22 (Figura complementaria 1a). Reconstruimos la cabeza E217 mediante reconstrucción alocalizada con simetría quíntuple impuesta (C5), que produjo una resolución de 2,8 Å con un corte de correlación de Fourier Shell (FSC) de 0,143. También visualizamos todos los componentes que se desvían de la simetría icosaédrica9 mediante reconstrucción localizada29 (Figura complementaria 1b) y un promedio de simetría local, que arrojó una resolución de 3,3 Å para el cuello, 3,1 Å para la vaina y 3,4 Å para la placa base (Figura complementaria 1c). , a FSC 0,143. Las densidades de electrones de alta calidad nos permitieron construir modelos de novo de todos los componentes en el cuello, la vaina y la placa base del fago, incluida la región más distal de las fibras de la cola. En total, construimos 19 nuevas cadenas polipeptídicas (Figura 2 complementaria), que se refinaron en el espacio real hasta un coeficiente de correlación (CC) final de ~0,70 a 0,88, lo que indica un excelente ajuste de modelo a mapa (Tabla 1). El tratamiento con pH alcalino desencadenó la contracción de la vaina in vitro22, exponiendo ~500 Å del tubo de cola (Fig. 1b), aunque la resolución de las partículas vacías contraídas y desprovistas de ADN se limitó a 4,5 Å. La Figura 1a, b muestra reconstrucciones compuestas del E217 con la cola extendida y contraída que representa la conformación previa y posterior a la eyección obtenida combinando diferentes mapas crio-EM (p. ej., cápside C5: EMD-29406; cuello C6: EMD-29487; C6 extendido: EMD-29481; vaina C6 contraída: EMD-29486; placa base C3: EMD-28405).

Reconstrucciones crio-EM compuestas del virión E217 a pH neutro (a) y después de la incubación a pH alcalino (b). c Vista ampliada de la proteína cementante trimérica gp25 que decora la cápside icosaédrica.

La cabeza E217 tiene un diámetro máximo de 790 Å y está formada por 535 copias de la proteína principal de la cápside gp25. Nos referiremos a la reconstrucción del virión E217 a pH neutro con una cola extendida (Fig. 1a) que se determinó con una resolución FSC = 0,143 de 2,8 Å (Fig. 1c complementaria), aunque no se observaron diferencias significativas en el E217. cabeza debido a la alcalinización. La proteína de la cápside principal E217, gp25, adopta un pliegue canónico HK9730 (Figuras complementarias 3a-c) y está organizada en una red hexagonal con un número de triangulación T = 931. Los primeros 65 aminoácidos de gp25 no fueron visibles en la reconstrucción. lo que sugiere que esta fracción podría escindirse durante la maduración o estar desordenada en nuestra reconstrucción. El resto de gp25 (res. 66–382) adopta un pliegue HK97 que una búsqueda DALI32 identificó como más similar a la proteína de la cápside principal del sifovirus marino TW1 (PDB 5WK1 [10.2210/pdb5wk1/pdb])33, que es sólo 10% idéntico a E217 gp25 en secuencia de aminoácidos. El RMSD entre las proteínas de la cápside E217 y TW1 es de 8,8 Å para 274 átomos de Cα alineados de 296 y 317 Cα, respectivamente (Figura complementaria 3d).

La cabeza icosaédrica E217 está decorada con 180 copias de una proteína trimérica, gp24 (res. 1-211), que se une a los ejes icosaédrico triple y cuasi triple (Fig. 1a, b), generando una protuberancia superficial. Gp24 adopta un pliegue de tulipán β34 (Fig. 1c), como la proteína decorativa gp87 que se encuentra en el fago termófilo P74-2635. Cada subunidad gp24 consta de dos láminas β antiparalelas, dispuestas como los pétalos de una flor, para formar una estructura similar a un tulipán. Un brazo N-terminal extendido (res. 1 a 25) emana de cada subunidad y se empaqueta lateralmente con un bucle omega que conecta los residuos 58 a 75 de una subunidad adyacente (Figura complementaria 4a). Cada trímero E217 gp24 contacta con tres proteínas decorativas vecinas y seis subunidades de proteína de la cápside en tres capsómeros adyacentes, enterrando una superficie total de ~8642 Å2. Los trímeros de Gp24 en los ejes triples / cuasi triples vecinos generan una jaula entre capsómeros (Figura complementaria 4b). La arquitectura interconectada de los trímeros gp24 se estabiliza mediante amplios contactos de van der Waals entre los brazos N-terminales y los bucles omega.

Una pentona única de la cápside E217 es reemplazada por la proteína portal dodecamérica gp19, que es un punto de unión para el aparato de la cola de ~1500 Å. La primera parte de la cola o cuello de E217 se visualizó en una reconstrucción localizada después de aplicar el promedio rotacional C12 o C6, lo que produjo mapas con una resolución de 3,3 y 3,4 Å (FSC = 0,143), respectivamente (Figura complementaria 1c). El mapa C12 se utilizó para construir modelos de novo de la proteína portal dodecamérica gp19 (res. 97–528 de 765) y el adaptador de cabeza a cola gp27 (res. 1–155) (Fig. 2a y Fig. Suplementaria. 2). La densidad bajo el factor cabeza-cola se resolvió mejor en un mapa C6, lo que es consistente con una reducción de la simetría rotacional. Identificamos y construimos seis copias de la proteína del collar gp28 (res. 1-132) y la puerta de enlace gp29 (res. 1-183) (Fig. 2a, by Fig. complementaria 2).

Vistas en sección del área del cuello E217 en conformaciones previas (a) y posteriores a la eyección (b). Los modelos atómicos refinados se superponen con la densidad crio-EM mostrada en un contorno de 3,5 σ sobre el fondo. c, d Vistas superiores del hexámero de entrada (naranja) unido a seis proteínas de vaina (púrpura) en las conformaciones previas y posteriores a la eyección. Los paneles ampliados revelan un detalle de la asociación puerta de enlace:funda. La cadena β n.° 3 del C-terminal de entrada (coloreada en rojo) forma una lámina β intermolecular con el giro β C-terminal de la proteína de la vaina (hebras n.° 1 a 2, coloreadas en azul).

La proteína portal E217 comparte el pliegue de la proteína portal general10. Sin embargo, algo inesperado para Myoviridae, el portal E217 también contiene un cilindro α-helicoidal C-terminal que se proyecta hacia la cabeza (Fig. 2a). El dominio barril ha sido predicho36 y observado experimentalmente en fagos de Podoviridae como P2236,37,38 y Sf639, pero no se ha encontrado en Myoviridae40. Curiosamente, el barril se pliega solo en la conformación previa a la eyección cuando el ADN llena la cápside (Fig. 2a). La reconstrucción previa a la eyección también reveló una densidad continua que atraviesa la proteína portal y el canal del cuello (Fig. 2a), consistente con el ADN bicatenario (ADNbc). Por el contrario, el tratamiento con pH alcalino desencadenó la contracción de la cola de E217 y la expulsión del genoma. Inesperadamente, el barril de proteína portal se desestructura en el estado posterior a la eyección debido a la falta de interacciones de unión con el ADNbc (Fig. 2b), como en la procápsida P2238. El dodecámero portal E217 está unido a doce copias del factor cabeza-cola gp27, que se parece mucho al P22 gp437. Gp27 se ensambla en el portal insertando su cola C-terminal extendida en la interfaz generada por dos subunidades del portal, lo que sugiere que el factor cabeza-cola se oligomeriza al unirse en lugar de existir como un anillo dodecamérica preformado41.

Los otros dos factores del cuello, gp28 y gp29, reducen a seis veces la simetría C12 encontrada en el portal y de la cabeza a la cola, que se mantiene en la mayor parte del aparato de la cola. Gp28 consta de un pequeño barril β decorado por una hélice α N-terminal prominente y dos extensiones laterales (res. 28–38 y 56–66) (Figura complementaria 5a) que le dan la apariencia de una silla de montar. Seis proteínas del collar se empaquetan debajo del dodecámero de cabeza a cola con la hélice N de gp28 colocada ortogonalmente a dos subunidades de gp27, lo que explica el desajuste de simetría C12: C6 (Figura complementaria 5b). En el lado opuesto del cañón gp28, las alas hacen contacto con dos subunidades de entrada como una silla de montar sobre un caballo (Figura complementaria 5b).

El último factor del cuello, gp29, conecta el cuello con la red de la vaina (Fig. 2a, b). Gp29 comparte una identidad de secuencia del 10% con la proteína terminadora de la cola del fago lambda (gpU-D74A), que también es hexamérica42. Hace dos conjuntos de contactos: en un extremo, se asienta sobre el tubo hexámero construido por la proteína del tubo de la cola gp32, generando una cresta continua de lámina β que delimita la luz de la cola (que se describe a continuación). Por otro lado, seis extensiones C-terminales de gp29 (res. 172-182) se extienden hacia afuera para reclutar seis proteínas de vaina ubicadas lateralmente a la puerta de enlace (Fig. 2c). Las proteínas del collar y de la vaina se asocian formando una lámina β intermolecular de 3 cadenas. Este elemento de estructura secundaria está formado por un giro β C-terminal en la proteína de la vaina (cadenas β # 1 y # 2, res. 460–488) (Fig. 2c) y una extensión C-terminal gp29 (cadena β # 3, resoluciones 172–182). El collar de puente intermolecular de la hoja β y las proteínas de la vaina se mantienen en el estado contraído, donde el brazo C-terminal gp29 oscila ~ 25 ° para adaptarse a un aumento en el diámetro de la vaina a 250 Å (Fig. 2d).

La vaina E217 consta de 204 copias de la proteína de la vaina de la cola gp31 (res. 1-204)43 que rodea 34 anillos hexaméricos estacados de la proteína del tubo de la cola gp32. Determinamos reconstrucciones crio-EM de la vaina E217 extendida y contraída con una resolución de 3,1 Å (FSC = 0,143) (Figura complementaria 1c). Los cambios de estructura terciaria y cuaternaria en la proteína de la vaina gp31 provocan la contracción de la vaina. A nivel de estructura cuaternaria, la conformación extendida de la vaina E217 consiste en un tubo helicoidal de ~ 205 Å de diámetro que tiene un paso regular de 490 Å y una elevación y torsión de 40,8 Å y 31,3 °, respectivamente (Fig. 3a). La vaina extendida es porosa, con aberturas visibles entre las subunidades. El lumen interno es de ~75 Å y alberga el tubo de cola (descrito en la siguiente sección). La alcalinización o contracción espontánea durante la purificación, observada en aproximadamente el 20 % de todos los viriones a pH neutro, desencadena la contracción de la cola. Esto da como resultado la compresión de la vaina, con el paso disminuyendo a 265 Å y el diámetro exterior aumentando a 250 Å, mientras que la elevación y la torsión disminuyen a 22,1 Å y 30 °, respectivamente (Fig. 3b). Una superposición de los estados extendido versus contraída revela el notable grado de compresión de la vaina que pierde el 55% de su longitud para aumentar su diámetro en un 20% (Fig. 3c).

Reconstrucciones crio-EM de las vainas contraídas (a) y extendidas (b) calculadas con una resolución de 3,1 Å a 0,143 FSC y mostradas a 3 σ. c Diagrama de cinta de todas las subunidades de vaina en un paso helicoidal de vainas extendidas (púrpura) versus contraídas (cian). d Superposición de protómeros de vaina en las conformaciones extendida versus contraída. Tres regiones experimentan los reordenamientos conformacionales más significativos: el brazo N-terminal (res. 1-23), el giro β C-terminal (res. 460-488) y la cola C-terminal (res. 491-504).

La proteína de la vaina gp31 contiene tres dominios globulares, denominados A, B y C, y largos brazos de extensión N y C terminales (res. 1–23 y 491–504) que emanan de los dominios B y C, respectivamente (Suplementario). Figura 6a). Los dominios B y C de E217 tienen una similitud estructural sustancial con la proteína de la vaina de piocina R222, mientras que el dominio A, que falta en la vaina de piocina más pequeña22, se conserva en la proteína de la vaina de piocina T4 (Figura complementaria 6a). A pesar de la composición de dominio similar y la topología general, las proteínas de vaina E217 y T443 son muy diferentes en la secuencia y estructura de aminoácidos (RMSD ~26 Å con solo 5 átomos de Cα alineados de 504 y 479 Cα, respectivamente) (Figura complementaria 6b). .

Una superposición de la estructura secundaria de la proteína de la vaina E217 en las conformaciones extendidas versus contraídas (Fig. 3d) reveló que los brazos N-terminales experimentan un movimiento significativo, con una rotación de 80 ° alrededor del residuo 24 tras la contracción y un desplazamiento máximo de hasta 20 Å. . Se produce un movimiento más pequeño para el brazo C-terminal, donde los residuos 491–504 giran ~ 12 ° y el giro β (res. 460–488) (Fig. 2c, d) se desplaza ~ 8 Å. Curiosamente, estos tres restos (Fig. 3d) dictan el ensamblaje de las subunidades de la vaina en una red. En la vaina extendida, los tres restos se unen a partir de subunidades vecinas para formar una lámina β intermolecular de cuatro cadenas (Fig. 4a). Específicamente, una subunidad A de la vaina expone el giro β C-terminal (res. 460–488) que contiene las hebras β n.° 1 y n.° 2. El brazo N-terminal de una subunidad B de la vaina vecina ubicada sobre el plano de la subunidad A proporciona la hebra β n.° 3, y la hebra β n.° 4 se origina en el brazo C-terminal de una subunidad vecina, ubicada ligeramente por encima de la subunidad A pero rotada. agujas del reloj. En particular, esta cuarta hebra es más corta, con solo seis aminoácidos (res. 6 a 12) formando enlaces de hidrógeno de la cadena principal y tiene una curvatura pronunciada de 90° en Gly14. La contracción de la vaina da como resultado una reorganización dramática de la estructura cuaternaria con una rotación de ~ 17 ° en el sentido de las agujas del reloj de la lámina β y una extensión de la hebra β n.° 4 que se vuelve casi recta en el extremo C de Gly14 (Fig. 4a). Esto da como resultado una sorprendente compactación y contracción de la vaina que se expande en diámetro (Fig. 4b, c), exponiendo ~ 500 Å del tubo de cola desnudo (Fig. 1b).

una vista ampliada de la lámina β intermolecular formada por tres proteínas de la vaina, denominadas subunidades A, B y C. En el lado izquierdo está la asociación en la cola extendida antes de la contracción, mientras que en el panel derecho está la misma estructura secundaria elemento después de la contracción de la cola. En ambos paneles, la subunidad A expone los residuos 460–488 que abarcan el giro β (p. ej., las hebras β #1 y #2, coloreadas en rosa) que se unen por enlace de hidrógeno con la subunidad B, la hebra β #3 C-terminal (verde) y subunidad C N-terminal β-cadena #4 (amarillo). b Representación de la estructura cuaternaria de las tres subunidades de vaina A, B y C descritas en (a). c Una vista en sección de la funda E217 en los estados extendido versus contraído.

Los hexámeros apilados de la proteína del tubo de cola gp32 forman el tubo central de la cola E217. La proteína del tubo de la cola está estructuralmente conservada y es homóloga a la proteína del tubo de la cola que se encuentra en las colas no contráctiles, las piocinas bacterianas y los sistemas de secreción de tipo VI44. Gp32 consiste en un pliegue clásico tipo sándwich β que contiene dos láminas de 4 hebras enfrentadas entre sí y rodeadas por una hélice α larga (res. 67–79) y un giro β extendido (res. 35–56) ( Figura complementaria 7a). Seis copias de gp32 se ensamblan lateralmente para formar un hexámero hueco, cuya luz interna mide ~40 Å de diámetro. La interfaz entre las subunidades gp32 está estabilizada por 11 enlaces de hidrógeno, muchos de los cuales se forman entre los residuos expuestos por el giro β extendido. Sin embargo, la interfaz gp32:gp32 carece de contactos hidrófobos, lo que sugiere que la proteína del tubo de la cola puede permanecer monomérica en solución sin otros componentes de la cola45. La superficie interior del tubo está ligeramente cargada, con dos parches cargados, uno positivo, expuesto por Arg125/Lys127, y el otro negativo, formado por Asp27 (Figura complementaria 7b).

La interfaz entre el tubo de la cola y la proteína de la vaina varía según el estado de contracción de la cola. Antes de la eyección del genoma, cada subunidad del tubo de cola entra en contacto con una proteína de vaina generando una extensa superficie de interacción estabilizada por dos enlaces de hidrógeno, un puente salino y 99 contactos de van der Waals (Figura complementaria 7c). En particular, las subunidades de la vaina de la cola no entran en contacto entre sí en la cola extendida, sino que están conectadas únicamente por la asociación de sus giros β C-terminales y brazos N-/C-terminales (Fig. 4a, b). Al contraerse, los cuerpos de la vaina de la cola entran en contacto lateralmente, formando una red mucho más estrecha que libera una gran cantidad de energía26. Debido al mayor diámetro en el estado contraída (Fig. 4c), las subunidades de la vaina no forman uniones directas con el tubo de cola, cuyo único punto de contacto es con la extensión C-terminal de la puerta de enlace (Fig. 2d).

Determinamos una reconstrucción localizada de la placa base extendida con una resolución de 3,4 Å (FSC = 0,143) (Fig. 1a) y una reconstrucción de menor resolución después de la contracción (Fig. 1b). Construimos un modelo atómico completo de todos los factores en la placa base extendida, que consta de 11 proteínas únicas repetidas en 66 copias. La masa total de la placa base es 1,4 MDa excluyendo seis fibras de cola triméricas que emanan de las cuñas de la placa base. La placa base se ensambla en la punta del aparato de la cola, rompiendo la simetría repetitiva del tubo de la cola y la proteína de la vaina, creando una punta única para la unión del huésped, la adsorción celular y la expulsión del genoma. Nuestro análisis estructural sugiere que la placa base se puede subdividir en tres subcomplejos codificados por marcos de lectura abiertos (ORF) 36–46, que probablemente se ensamblan secuencialmente.

Primero, la tapa de la placa base (Fig. 5a y Fig. complementaria 2) formada por gp36, gp37/gp38, gp41 y gp43 se ensambla en el tubo de cola repetitivo, sellando el canal de expulsión del genoma. Gp36 (o tubo de cola B, res. 1–167) es similar al tubo de cola gp32 (RMSD 3,6 Å) y forma un anillo hexámero concéntrico a gp32. Este factor proporciona una superficie de unión a tres copias del heterodímero gp37/gp38 (res. 1–179 y res. 1–197, respectivamente) que generan un complejo triple simétrico bajo el hexámero gp36. Este desajuste de simetría permite la unión de la gp41 trimérica (res. 1–287) que restringe la luz y proporciona un punto de anclaje a la punta de la cola trimérica gp43 (res. 1–221), que sella la cola. La punta de la cola E217 es como otras puntas de Myorividae y consiste en un triple pliegue de hélice β46 99% idéntico en secuencia de aminoácidos a la proteína perforadora de células ORF41 del fago SN de Pseudomonas (PDB 4RU3).

un mapa crio-EM de 3,4 Å con todos los componentes de la tapa de la placa base superpuestos, a saber, gp36, gp37/gp38, gp41 y gp43. b Placa base como en (a) con la adición de (b) subunidades adaptadoras gp33 y gp34 y c tuerca de placa base formada por seis subunidades triplex. d Reconstrucción localizada de una fibra de la cola acoplada a la placa base extendida. e Una vista ampliada de la fibra trimérica de la cola gp46 (res. 1–340) se superpone con la densidad promedio triple, calculada con una resolución de 3,4 Å a 0,143 FSC y mostrada a 4 σ.

El segundo conjunto de proteínas en la placa base E217 incluye las subunidades adaptadoras gp33 (res. 1–107) y gp34 (res. 1–116) (Fig. 5b y Fig. 2 complementaria). La primera subunidad, gp33, se une a los ~40 aminoácidos C-terminales de gp37 y gp38 que se extienden hacia afuera, mientras que gp34 se une a la cresta de la hoja β formada por gp37/gp38, generando un anillo hexámero por encima de gp33. En particular, tanto gp33 como gp34 forman conjuntos hexaméricos que carecen de contactos dentro de la subunidad, lo que sugiere que estas proteínas son adaptadores en lugar de componentes estructurales discretos de la placa base.

El tercer subcomplejo en la placa base E217, o tuerca (Fig. 5c), está construido por seis copias del complejo triplex (Fig. 8a complementaria) que se ensamblan en la parte inferior de la placa base que rodea el complejo de tapa. Cada complejo triplex consta de dos conformadores de gp44 (res. 1–417), denominados gp44-a y gp44-b, y un gp45 (res. 1–504), ligeramente más grande que gp44 (Figura complementaria 8a). En particular, gp44-a y gp44-b son la misma proteína pero en conformaciones drásticamente distintas, con el conformador gp44-a globular y gp44-b extendido, como cuentas en una cuerda (Figura complementaria 8b). El área de interfaz entre gp45:gp44-a es significativamente más pequeña que la de gp45:gp44-b (1712,5 Å2 frente a 2801,2 Å2), lo que sugiere que los dos confórmeros existen como resultado de la plasticidad intrínseca de gp44 y los contactos de unión diferenciales con gp45.

La tuerca de la placa base proporciona un sitio de anclaje para las fibras de la cola (Fig. 5d), que tenían poca densidad en la reconstrucción crio-EM de la cola extendida. Sin embargo, una reconstrucción localizada de la fibra de la cola E217 reveló densidad para la porción N-terminal de la fibra. La resolución estimada de esta densidad se limitó a 7,3 Å (Fig. 5e), insuficiente para construir un modelo de novo. Luego generamos un modelo de predicción del gp46 trimérico usando AlphaFold2 (Figura complementaria 9a) 47. ORF46, ubicado inmediatamente después de la subunidad triplex gp45, codifica una proteína grande de 946 aminoácidos, la fibra de la cola E217. Ajustamos la fibra predicha en la densidad (Fig. 5e), con los 340 aminoácidos N-terminales en contacto con la subunidad triple gp45, lo que dio un ajuste excelente a la reconstrucción localizada (Fig. 5e) que mejoramos aún más mediante el espacio real. refinamiento. Al mismo tiempo, los residuos 341–964 de gp46 no tenían densidad visible en la reconstrucción crio-EM debido a su flexibilidad. Esta región de fibra se pliega en cinco dominios globulares, altamente enriquecidos en residuos de glicina (Figura complementaria 9a) que probablemente se mueven como el tentáculo de un pulpo.

La fibra de la cola E217 se une a la subunidad triplex gp45 (Figura complementaria 9b). La asociación entre estas dos proteínas es íntima. Un bucle largo en gp45 que abarca los residuos 76-123 (denominado bucle de unión de fibra gp45) (Fig. 5c) encaja perfectamente en la interfaz helicoidal trimérica generada por los extremos N de gp46 (Fig. 9b complementaria), que adopta una bobina enrollada. Estructura similar a la aguja de cola gp2648. La superficie total enterrada tras la unión es de 1125 Å2 y es rica en enlaces de hidrógeno y contactos de van der Waals (Tabla complementaria 1). A pH neutro, las fibras de la cola alternan una orientación hacia abajo y hacia arriba (Fig. 1a), lo que sugiere que el bucle de unión de la fibra gp45 permite la rotación de gp46.

El pH alcalino desencadena la contracción de la cola de E217 y la disociación de la placa base en dos componentes (Fig. 6a). Las subunidades de la tapa de la placa base gp36, gp37/gp38 y gp41 permanecen en la punta de la cola distal, perdiendo tanto el factor adaptador gp33 como la punta de la cola gp43 (Fig. 6b). Por el contrario, la tuerca de la placa base (p. ej., las subunidades gp44-a, gp44-b, gp45 y gp46) se mueve hacia arriba a lo largo del tubo de cola como un perno alrededor de una tuerca, firmemente unida al último anillo de proteínas de la vaina (Fig. 6c). . En particular, las seis fibras de la cola apuntan hacia abajo en el estado contraída, mientras que alternan posiciones hacia arriba y hacia abajo en la cola extendida (Fig. 1a, b).

a El mapa de densidad de la placa base contraída calculado a 5,3 Å se muestra a 2,5 σ. Las proteínas que lo componen se separan en dos partes: la tapa de la placa base (sin la punta de la cola) permanece en la parte inferior (b), mientras que la tuerca de la placa base (c) sube con la vaina contraída. Todas las fibras de la cola están en conformación hacia abajo después de la contracción.

La comparación de las estructuras de los complejos triplex en la nuez de la placa base antes y después de la contracción proporciona pistas para descifrar los mecanismos de contracción de la cola. En la cola extendida (Fig. 7a), gp44-a y gp44-b hacen un contacto de apretón de manos en el borde de la placa base. El dominio de pasador flexible de gp44-a (Fig. 8b complementaria) se gira aproximadamente 70 ° desde su dominio C-terminal (Fig. 7b), y seis dominios de pasador se extienden hacia afuera en el canal para hacer contacto con la punta de la cola. Por el contrario, en el estado contraído, gp44-a y gp44-b se deslizan alejándose uno del otro, haciendo contacto con la punta de los dedos en el borde de la placa base (Fig. 7c). A su vez, el dominio pin se mueve ~ 35 ° en sentido antihorario (Fig. 7d), plegándose sobre su dominio C-terminal y perdiendo la interacción de enlace con la punta de la cola. La rotación de los dominios de los pines lejos del tubo de la cola provoca la expansión de la luz y la liberación de la punta de la cola (Fig. 7e). Como se señaló anteriormente, la vaina contraída no hace contacto con el tubo de cola (Fig. 4c), que no cambia de conformación al contraerse debido a su rigidez.

a En la conformación extendida, los complejos triplex vecinos hacen contactos de apretón de manos con dominios de pin gp44-a que se proyectan hacia la punta de la cola. b El dominio pin Gp44-a está a ~70° de distancia del dominio C-terminal. c En la conformación contraída, los complejos triplex vecinos hacen contactos con las puntas de los dedos, y d los dominios pin gp44-a se alejan de la punta de la cola, colapsando sobre sus dominios C-terminales. e Vistas en sección de la placa base antes (izquierda) y después (derecha) de la contracción de la vaina. La retracción del dominio del pin provoca la expansión de la luz y la liberación de la punta de la cola.

Aislamos un mutante PAO1 espontáneo resistente a E217, al que denominamos 4a en la Fig. 8a. E217 no pudo adsorberse en 4a (Fig. 8b), lo que sugiere que el mutante 4a puede tener un receptor de fago alterado o ausente. Dado que muchos fagos de Pseudomonas caracterizados hasta ahora explotan el lipopolisacárido del huésped (LPS) como receptor49,50,51, analizamos el LPS 4a mediante electroforesis en gel. Encontramos que las bandas correspondientes a especies de LPS cubiertas con el antígeno O, presentes en el LPS de la cepa PAO1 parental (p. ej., las bandas Cm y Cl en la Fig. 8c), estaban ausentes en el LPS 4a (Fig. 8c). . Además, la preincubación de E217 con el LPS extraído de PAO1, y no de 4a, deterioró la infección por fagos (Fig. 8d), muy probablemente porque las proteínas de unión al receptor de fagos (RBP) se unieron al LPS PAO1 y no pudieron interactuar con el LPS. 4a LPS. En general, estos datos son consistentes con la fracción de antígeno O del LPS como receptor del fago E217.

a E217 no forma placas en el mutante 4a. Se replicaron diluciones en serie (× 100) de una solución madre de E217 en PAO1 o 4a y se usaron como indicadores. b E217 (barra amarilla) tiene una adsorción defectuosa en 4a (barra marrón). Las barras representan promedios (N = 4) con desviación estándar. ****P < 0,0001 estimado con una prueba T de dos colas, con P = 7,26E-05. c El mutante 4a tiene LPS defectuoso que carece de las formas Cm y Cl, es decir, el LPS con antígeno O de cadena media y larga. U, LPS sin tope; C + 1, LPS cubierto con una única repetición de antígeno O63,79. La posición de los marcadores MW se indica a la izquierda en kDa. d La preincubación de E217 con LPS extraído de PAO1 (barras amarillas) pero no de 4a (barras marrones) perjudica la infección por fagos. Las barras indican eop promedio (N = 3) con desviación estándar. Las barras indicadas con las mismas letras no son significativamente diferentes según ANOVA y el análisis post-hoc de Tuckey (con F = 18,03179 y P = 3,29E-05). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El análisis de anotación de dominio de la fibra de la cola E217 identificó un dominio de unión a carbohidratos (CBD) N-terminal, un dominio de unión a lectina y un segundo CBD en el medio de la fibra, y un dominio de α-amilasa C-terminal (Figura complementaria 9a). ). Los CBD pueden unirse a unidades de LPS, mientras que el dominio de unión a lectina es un supuesto receptor de unión al antígeno O, como se sugiere para las fibras de la cola de piocina tipo R52. Los dominios de unión a lectina contienen un pliegue en forma de gelatina con una red de bucle distal variable implicada en la unión al antígeno O LPS. Por el contrario, el dominio α-amilasa pertenece a la clase de O-glucosil hidrolasas, enzimas muy extendidas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos o entre un carbohidrato y un resto no carbohidrato53 que se encuentran comúnmente en las puntas y fibras de la cola de Podoviridae de muchos lactofagos13. Sin embargo, la fibra E217 carece de actividad hidrolítica de LPS in vitro.

Las infecciones causadas por el patógeno gramnegativo P.aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La terapia con fagos contra P. aeruginosa ha ganado atención como un arma terapéutica prometedora en la lucha contra las infecciones relacionadas con la FQ54,55.

E217 es un fago similar a PB1 que forma parte de un cóctel de fagos experimental para erradicar las infecciones por P. aeruginosa in vivo1,2,3. En nuestro estudio, describimos la estructura atómica del fago E217, que resolvimos combinando el poder de las reconstrucciones icosaédricas y localizadas.

Descubrimos que E217 tiene una cápside icosaédrica T = 9 decorada por gp24, una proteína probablemente cementante que estabiliza la cápside E21756. Definimos las estructuras atómicas de todos los componentes del cuello, es decir, los factores cabeza-cola, collar y puerta de enlace, que conectan la cabeza icosaédrica con la cola contráctil. Al comparar las colas extendidas versus las contraídas, determinamos que el cuello no sufre cambios conformacionales globales debido a la contracción, a excepción del barril portal que desaparece después de la expulsión del genoma y la extensión C-terminal de la puerta de enlace que gira para permitir la contracción de la vaina. Desciframos la disposición terciaria y cuaternaria de la proteína de vaina E217 que forma una malla intermolecular compleja. La proteína de la vaina E217 se parece topológicamente a la contraparte T443, que también consta de tres dominios como E217 gp31. Sin embargo, es muy diferente en la secuencia y estructura de aminoácidos, lo que subraya cómo se puede conservar una estructura terciaria similar en diferentes virus con una identidad de secuencia mínima57. Las subunidades de vaina hacen extensos contactos laterales en el estado contraída, proporcionando la contribución energética que hace que esta conformación sea termodinámicamente estable. Por el contrario, las subunidades de la vaina son porosas en la conformación extendida y se mantienen unidas sólo por una lámina β intermolecular. Por lo tanto, las proteínas de la vaina E217 crean una malla bidimensional reticulada con conectividad similar en el estado extendido y contraído de la vaina22,23 pero con diferente topología y diámetros exteriores.

Desciframos la arquitectura completa de la placa base E217 que racionalizamos como dos complejos, un complejo de tapa inactiva que sella el extremo distal del tubo de cola y un complejo móvil, la tuerca, que se fija a la tapa mediante factores adaptadores, gp33 y gp34. . Curiosamente, las cuatro proteínas del complejo de la tapa, gp36, gp37, gp38 y gp41, están relacionadas evolutivamente con el tubo de la cola y adoptan un pliegue similar, que consta de dos láminas β empaquetadas ortogonalmente que forman la luz interna de la cola46. La caída de simetría desde el tubo de cola séxtuple hasta la punta de la cola trimérica se transmite a través del complejo heterodimérico gp37/gp38, que también recluta los adaptadores gp33 y gp34. La tuerca de la placa base se ensambla fuera de la tapa como una corona y permanece unida a la vaina después de la contracción. La nuez se mueve a lo largo del tubo de la cola durante la contracción, perdiendo el factor adaptador gp33, mientras que, al mismo tiempo, se expulsan la punta de la cola gp43 y el genoma viral. La plasticidad en el complejo triplex refleja principalmente la conformación de cuentas en una cuerda gp44-a, que puede adoptar dos conformaciones cuasi equivalentes antes y después de la contracción. Esta observación extiende efectivamente el principio de cuasiequivalencia de Caspar y Klug31, bien establecido para las proteínas de la cápside, a un factor de placa base conservado en Myoviridae. Al igual que las proteínas de la cápside viral pueden adoptar posiciones localmente similares pero no idénticas a lo largo de la superficie de la cápside, lo que permite que una sola proteína se cierre en una jaula icosaédrica, la cuasiequivalencia de la subunidad triplex E217 gp44-a determina dos formas de cementar el tubo de la cola.

Los resultados presentados en este artículo nos permiten formular un modelo de cómo la unión de E217 a la superficie de Pseudomonas desencadena la expulsión del genoma del fago a través del tubo de la cola14. Visualizamos cuatro pasos en este proceso de infección (Fig. 9a).

a Representación esquemática de E217 que infecta a P.aeruginosa. Se muestran cuatro pasos propuestos de infección. Cada paso va acompañado de distintas conformaciones de las fibras de la cola y cambios conformacionales en la placa base, como se muestra en los paneles inferiores. b Diagrama de la placa base E217 (vista desde abajo) en las conformaciones extendida (izquierda) y contraída (derecha), enfatizando la posición del dominio de pin gp44-a. Las fibras de la cola están coloreadas en violeta: el violeta claro y oscuro representan las fibras de la cola que se proyectan por debajo y por encima del avión. Las imágenes fueron creadas con BioRender.com.

Paso 1: Las fibras de la cola de E217 están en constante movimiento browniano, ondulándose hacia arriba y hacia abajo, como se ve en la reconstrucción de E217 con una cola extendida. A diferencia del T4, el E217 tiene un solo tipo de fibra en la cola, construida como cuentas en una cuerda. Las fibras de la cola funcionan como un dispositivo de sondeo, fluctuando estocásticamente para mejorar las posibilidades de encontrar un receptor.

Paso 2: La asociación de una fibra gp46 con el antígeno O del huésped a través de un dominio de unión a lectina (Figura complementaria 9a) da como resultado la unión del fago a la superficie del huésped. Esta reducción de la dimensionalidad tridimensional desencadena una cascada de absorción cooperativa, mediante la cual otras fibras fluctúan hacia abajo y contactan con el LPS huésped, como se propone para las fibras cortas T419.

Paso 3: Después de que al menos dos fibras de cola se hayan adherido a la superficie del huésped, se transmite una señal mecánica desde gp46 al complejo triplex a través del bucle de unión de fibra flexible en gp45 (Figura complementaria 9b). Específicamente, la tracción lateral de gp45 provoca un cambio en la asociación gp44-a/b desde un apretón de manos hasta contactos con las puntas de los dedos y el colapso del dominio del pin gp44-a. En la conformación metaestable extendida, el dominio pin gp44-a hace un contacto débil con la punta de la cola (Fig. 9b, izquierda), reteniendo la punta de la cola en el complejo de la tapa y estabilizando la vaina extendida.

Paso 4: Después de la unión de la fibra y el tirón lateral de gp45, el dominio del pin gp44-a se retrae desde la punta de la cola, colapsando contra el dominio C-terminal de gp44-a y borrando el único punto de contacto entre la tuerca y el tubo de cola (Fig. 9b, derecha). Como resultado, la tuerca, formada por seis complejos triplex, se desacopla del tubo de cola y se mueve hacia arriba como una tuerca alrededor de un perno. La fuerza impulsora de la contracción de la vaina es la formación de enlaces intermoleculares entre las proteínas de la vaina que liberan energía al agregarse en una red 3D26. Mientras que las fibras de la cola están ancladas al LPS del huésped, la contracción de la vaina permite que el fago se acerque a la superficie del huésped, penetrando el periplasma con su tubo de la cola. La superficie del huésped es un estator, y debido a que el complejo de la tuerca de la placa base está unido a las fibras de la cola, la contracción de la vaina con las fibras de la cola unidas al LPS da como resultado la inserción del tubo de la cola a través del OM hacia el periplasma como una aguja de jeringa. La compresión de la vaina se permite por la forma en que la proteína de entrada se sujeta a la primera capa de proteínas de la vaina, formando una lámina β resistente pero flexible que puede estirarse para adaptarse a la expansión de la vaina.

No está claro si el tubo de la cola penetra en el IM proporcionando un canal para la eyección del genoma hacia el citoplasma del huésped, o si se abre un orificio transitorio tras la expulsión de la punta de la cola mediante la fusión del tubo de la cola con la membrana interna19. Los genomas de Myoviridae como E217 permanecen en gran medida inexplorados, y también es posible que estos fagos codifiquen proteínas de eyección58 similares a T7 gp16 que se expulsan a través del tubo de la cola para formar un canal IM para la eyección del genoma59.

En resumen, hemos descifrado la arquitectura y los principios de diseño de un fago prototípico similar a PB1 utilizado en un cóctel experimental de terapia con fagos. Proponemos que los principios estructurales dilucidados en este trabajo se conserven en otros Myoviridae de la extendida familia PB1. La estructura completa y la dinámica conformacional de E217 arrojan luz sobre los miófagos de Pseudomonas utilizados para la terapia con fagos, profundizando la comprensión de los fagos como biomedicinas. Anticipamos que el atlas 3D de las proteínas estructurales E217 descritas en este artículo permitirá el mapeo de mutaciones de resistencia y facilitará la identificación de ORF en fagos de Pseudomonas relacionados utilizados en cócteles de terapia con fagos.

La cepa PAO160 de P. aeruginosa se cultivó a 37 °C hasta una DO600 = 0,5 (aproximadamente 2,5 × 107 ufc ml-1) en caldo Luria (LB) y se infectó con E217 fago1 GenBank NC_042079) con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001. El crecimiento continuó hasta que se detectó la lisis celular como una caída en la DO600. El lisado se incubó durante 30 min a 37 °C con 1 µg ml-1 de DNasa y RNasa antes de la centrifugación a 5000 xg durante 10 min. Después de la filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,45 µm, se disolvieron en el sobrenadante 58 g L-1 de NaCl y 105 g L-1 de polietilenglicol (PEG) MW 6 K. La solución se agitó aproximadamente 16 h a 4 °C antes de sedimentar las partículas de fagos a 20.000 x g a 4 °C durante 30 min. Los sedimentos se resuspendieron en tampón TN (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8) y la mezcla de fagos se centrifugó en un gradiente escalonado de cloruro de cesio de 1,3 a 1,6 g cc-1 de cloruro de cesio, de arriba a abajo, formado en tubos de ultracentrífuga de polialómero para rotor Beckman SW41. La mezcla de fagos (3 ml) se aplicó en la parte superior del gradiente y los gradientes se centrifugaron a 100.000 × g durante 120 min a 4 °C en una ultracentrífuga Beckmann Optima XE-90 usando un SW41. rotor. Las bandas de fagos, que normalmente sedimentan en la interfaz entre los pasos de 1,5 g cc-1 y 1/0,6 g cc-1, se extrajeron de los tubos con una jeringa, se transfirieron a tubos de polialómero para un rotor Beckman SW60 y se centrifugaron ca. 16 h a 150.000 × g en una ultracentrífuga Beckmann Optima XE-90 con un rotor SW60. Las bandas de fagos se recogieron como se indicó anteriormente y se dializaron 2 veces durante 20 minutos contra agua y luego 16 h contra tampón TN, se filtraron a través de filtros de 0,22 µm y se almacenaron a 4 °C.

Se utilizó la cepa PAO1 y su derivado 4a, concretamente un mutante espontáneo resistente a E217. En total, se incubaron 03 × 109 ufc de PAO1 o 4a durante 10 minutos a 37 ° C con ca. 08 × 103 unidades formadoras de placa (ufp) de E217 en 1 ml de LB. Las células bacterianas con fagos adsorbidos se sedimentaron mediante centrifugación a 5000 xg durante 10 minutos y el fago libre en el sobrenadante se tituló utilizando PAO1 como indicador. La eficiencia de adsorción (%) se calculó según la fórmula [1-(fago libre/entrada de fago)] × 100.

Los cultivos de PAO1 y 4a se cultivaron en 50 ml de LB a 37 °C hasta una DO600 = 0,8 y se centrifugaron durante 15 minutos a 5000 xg. El LPS se extrajo de los sedimentos bacterianos con fenol caliente y éter dietílico como se describe en la ref. 61. Después de la extracción, las muestras de LPS se liofilizaron durante ~20 h, y los sedimentos se pesaron y se resuspendieron en tampón TN a 10 mg ml-1. El LPS (5 µg) se visualizó mediante SDS-PAGE con tricina al 18% seguido de tinción con plata62,63.

Para evaluar la unión de LPS, se incubaron 103 ufp de E217 con 500 µg, 50 µg, 5 µg de LPS extraído de PAO1 o 4a o se incubaron de forma simulada sin LPS durante 60 minutos a 37 °C en un volumen final de 0,15 ml de tampón TN. . Las muestras se mezclaron con 0,3 ml de cultivo PAO1 durante la noche y 2,5 ml de agar blando y se sembraron en placas de agar LB. La eficiencia del cultivo en placas (eop) se midió contando las placas después de una incubación durante la noche a 37 °C y normalizándola con el número de placas obtenidas en muestras incubadas de forma simulada.

En total, se aplicaron 2,5 µl de viriones maduros E217 en 1 × 1014 fagos ml-1 a ​​una rejilla de carbón perforado (EMS) Quantifoil R 2/1 de cobre de malla 200, previamente descargada incandescentemente durante 60 s a 15 mA utilizando un easiGlow ( PELCO). La rejilla se secó durante 7,5 s con fuerza de transferencia 2 y se vitrificó inmediatamente en etano líquido usando un Vitrobot Mark IV (FEI). Las crio-rejillas se examinaron en un microscopio electrónico de criotransmisión Thermo Scientific Glacios equipado con un detector Falcon 4 y operado con una interfaz TEM (Talos v7.x, TEM v7.X, TIA v5.X, FluCam Viewer v7.X), en Universidad Thomas Jefferson. Se utilizó el software EPU (v2.X) para la recopilación de datos utilizando el modo de posicionamiento preciso. Para la recopilación de datos de alta resolución, se recolectaron micrografías en un microscopio Titan Krios operado a 300 kV y equipado con una cámara detectora de electrones directa K3 (Gatan) en la Instalación Nacional de Microscopía Crioelectrónica (NCEF) en el Laboratorio Nacional Frederick, MD. Las micrografías se recogieron en modo de conteo con un filtro de energía de un tamaño de píxel de imagen de 1,12 Å, un aumento nominal de ×81.000, una dosis total de 50 e/Å2, 40 fotogramas y un rango de desenfoque de −0,75 a −1,5 μm. Para desencadenar la contracción de la vaina, se incubó el fago E217 a 1 x 1014 fagos ml-1 durante la noche en tampón carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH = 11,4) a 4 °C. Luego se dializó el E217 contraído contra tampón PBS (pH = 7,5) en una proporción de 1:1000 durante la noche a 4 °C y se concentró en una unidad de concentración por centrifugación con un límite de 100 kDa. Los procedimientos de vitrificación del E217 contratado fueron los mismos que los del E217 a pH neutro descritos anteriormente. Los datos de alta resolución para el E217 contratado se recopilaron en el Centro Nacional de Acceso y Capacitación Cryo-EM (NCCAT). Los parámetros de recopilación de datos adicionales se encuentran en la Tabla 1.

Las películas de fotogramas múltiples del fago nativo E217 se corrigieron con movimiento con MotionCor264, lo que produjo 22.015 micrografías. La implementación de corrección de movimiento de RELION se aplicó a las micrografías con opciones de micrografías promedio ponderadas por dosis y la suma de espectros de potencia no ponderados por dosis cada 4 e-/Å2. La estimación de CTF (función de transferencia de contraste) se llevó a cabo utilizando CTFFIND465. Después de una ronda inicial de selección de referencias y clasificación 2D, 15.517 partículas de virión fueron sometidas a una reconstrucción de baja resolución sin referencias y sin imponer simetría. Luego, las partículas se clasificaron en 3D en cuatro clases con simetría I4 impuesta. De las cuatro clases, una clase de 15.505 partículas tuvo la reconstrucción más resuelta y fue sometida a un refinado automático 3D para alinear las partículas finamente. Luego, las partículas se expandieron según la simetría I4 utilizando la función relion_particle_symmetry_expand de RELION para relajar las orientaciones de las partículas que se utilizarán en los siguientes pasos de reconstrucción localizada. Se generó una máscara cilíndrica (radio = 150 Å) usando SCIPION 3.066 y luego se volvió a muestrear en un mapa de referencia que cubre el vértice quíntuple en UCSF Chimera67. Luego, la máscara cilíndrica se usó para una clasificación 3D sin muestreo sin imponer simetría para buscar la cola. Luego se combinaron partículas alineadas localmente de dos clases y se eliminaron los duplicados, lo que produjo 13.257 partículas. El mapa de referencia localizado inicial se reconstruyó directamente a partir de una de las clases utilizando la función relion_reconstruct de RELION. Las partículas alineadas con la cola se refinaron aún más, imponiendo simetría C5 y C6, con el objetivo de alinear la cápside y la cola larga, respectivamente. Las partículas alineadas C5/C6 se sometieron a una tercera clasificación 3D, eliminando las partículas heterogéneas hasta 10.826. Las partículas de cola localizadas alineadas finales se refinaron y pulieron con CTF. Las simetrías de los componentes del tubo de cola presentados en este estudio se derivaron de la inspección de los mapas de densidad electrónica y de la asociación con estudios previos sobre otros tubos de cola de Myoviridae22 en lugar de ab initio del análisis de los espectros de potencia de los tubos de cola E217.

Para reconstruir la placa base, seleccionamos manualmente 12.442 partículas que contenían la punta distal de la cola E217 y reconstruimos la placa base con simetría C6. Luego se llevó a cabo una expansión de simetría C6 y una búsqueda de características C3 para la placa base. Todos los pasos de SPA, incluida la clasificación 2D/3D, el refinamiento 3D, el refinamiento CTF, el pulido de partículas, el posprocesamiento y el cálculo de resolución local, se llevaron a cabo utilizando RELION 368,69. Las densidades finales se agudizaron usando phenix.auto_sharpen70. Se utilizó RELION_postprocess68,69 para la estimación de la resolución local, y se generaron dibujos de mapas de densidad electrónica y mapas de resolución local utilizando ChimeraX71. Funda contraída. Para obtener una reconstrucción de alta resolución de la vaina contraída de E217, se seleccionaron partículas vacías con colas contraídas de 22.714 películas recolectadas en un Krios/K3 de 300 kV y se procesaron como se detalla anteriormente. Después de una extensa selección de partículas y clasificación 2D, se reconstruyeron 10.126 partículas de cola contraídas en simetría C6.

Todos los modelos atómicos de novo presentados en este artículo, excepto el fragmento N-terminal de la fibra de la cola, se construyeron de novo usando Coot72 o Chimera67 y se refinaron usando varias rondas de refinamiento de cuerpo rígido, espacio real y factor B usando phenix.real_space_refinement73. . Todos los modelos finales se validaron utilizando MolProbity74 (Tabla 1). Utilizamos seis mapas diferentes para la construcción del modelo (Figura complementaria 1c): (i) un mapa de 2,8 Å combinado de reconstrucción icosaédrica y localizada de la cabeza madura que reveló la estructura atómica de la cápside E217 y la proteína decorativa; (ii) una reconstrucción localizada con un promedio de 3,3 Å C12 utilizada para construir la proteína portal dodecamérica unida a doce copias del adaptador de cabeza a cola; (iii) una reconstrucción localizada con un promedio de 3,4 Å C6 utilizada para construir modelos hexaméricos del collar, la puerta de enlace y el tubo de cola; (iv) densidades de 3,1 Å C6 de vainas extendidas o contraídas utilizadas para modelar proteínas de vaina; (v) un C6/C3 de 3,4 Å de la placa base extendida que permitió modelar las 66 cadenas polipeptídicas; (vi) un C6/C3 de 4,5 Å de la placa base contraída utilizada para colocar diferentes componentes de la placa base manualmente, y luego refinada usando el comando de ajuste en el mapa en Chimera67 y phenix.real_space_refinement73. Finalmente, los extremos N de la fibra de la cola (res. 1–340) se modelaron en una reconstrucción asimétrica enfocada generada a partir del mapa expandido de simetría C6 de la placa base, utilizando una máscara cilíndrica que cubre solo una fibra de la cola. La fibra de la cola de longitud completa se modeló en fragmentos utilizando AlphaFold247. Los primeros 340 aminoácidos se colocaron manualmente en la reconstrucción enfocada de 3,6 Å de la fibra de la cola y se refinaron en espacio rígido y real, produciendo un CC final = 0,84 (Tabla 1).

Todas las representaciones de cintas y superficies se generaron utilizando ChimeraX71 y PyMol75. Los vecinos estructurales se identificaron utilizando el servidor DALI32. Las interfaces de unión se analizaron utilizando PISA76 y PDBsum77 para determinar las interacciones de unión y las distancias interatómicas. La Tabla complementaria 1 proporciona una lista completa de interacciones en interfaces con simetría no coincidente. La anotación de dominio para gp46 se realizó utilizando SMART78. El RMSD entre PDB superpuestos se calculó utilizando SuperPose versión 1.0 (superpose.wishartlab.com) y Matchmaker en ChimeraX71. El potencial electrostático de Coulombic se calculó y se mostró con coloración de superficie utilizando ChimeraX71.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas para la cápside E217: complejo proteico decorativo, portal: cabeza a cola: collar: complejo de entrada, complejo vaina extendida: tubo, vaina contraída, complejo de placa base extendida se han depositado en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 8FRS, 8FVH, 8FUV, 8FVG y 8EON, respectivamente. Los mapas de densidad crio-EM generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Banco de datos de microscopía electrónica con el código de acceso EMD-29406, EMD-29487, EMD-29481, EMD-29486 y EMD-28405. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Forti, F. y col. Diseño de un cóctel de bacteriófagos de amplio espectro que reduce las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y trata infecciones agudas en dos modelos animales. Antimicrobiano. Agentes Chemother. 62, https://doi.org/10.1128/AAC.02573-17 (2018).

Levitas, Y. et al. Una IgG monoclonal humana que se une a conjuntos abeta y diversos amiloides exhibe actividades antiamiloideas in vitro e in vivo. J. Neurosci. 35, 6265–6276 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cafora, M. et al. Terapia con fagos contra infecciones por Pseudomonas aeruginosa en un modelo de pez cebra con fibrosis quística. Ciencia. Rep. 9, 1527 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Ackermann, HW Observaciones y evolución de bacteriófagos. Res. Microbiol. 154, 245–251 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Watkins, SC, Sible, E. y Putonti, C. Fagos similares a Pseudomonas PB1: genomas completos de metagenomas ofrecen información sobre un grupo abundante de bacteriófagos. Virus 10, https://doi.org/10.3390/v10060331 (2018).

Malki, K. y col. Los bacteriófagos aislados del lago Michigan demuestran una amplia gama de huéspedes en varios filos bacterianos. Virol. J. 12, 164 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Neves, PR et al. Secuencia completa del genoma de un miovirus lítico similar a F8 (varphiSPM-1) que infecta a Pseudomonas aeruginosa productora de metalo-beta-lactamasa. Anuncio del genoma. 2, https://doi.org/10.1128/genomeA.00061-14 (2014).

Pourcel, C., Midoux, C., Latino, L., Petit, MA y Vergnaud, G. Secuencias completas del genoma de los fagos de Pseudomonas aeruginosa vB_PaeP_PcyII-10_P3P1 y vB_PaeM_PcyII-10_PII10A. Anuncio del genoma. 4, https://doi.org/10.1128/genomeA.00916-16 (2016).

Parent, KN, Schrad, JR y Cingolani, G. Rompiendo la simetría en cápsides icosaédricas virales vistas a través de las lentes de cristalografía de rayos X y microscopía crioelectrónica. Virus 10, https://doi.org/10.3390/v10020067 (2018).

Dedeo, CL, Cingolani, G. & Teschke, CM Proteína portal: el orquestador del ensamblaje de la cápside para los bacteriófagos con cola de ADNds y los herpesvirus. Año. Rev. Virol. 6, 141-160 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lokareddy, RK y cols. Subunidades de terminasa del fago E217 de Pseudomonas. J. Mol. Biol. 434, 167799 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Black, LW & Rao, VB Estructura, ensamblaje y empaquetamiento del ADN de la cabeza del bacteriófago T4. Adv. Resolución de virus. 82, 119-153 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leiman, PG y cols. Morfogénesis de la cola T4 y de las fibras de la cola. Virol. J. 7, 355 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yap, ML y cols. Papel de la placa base del bacteriófago T4 en la regulación del ensamblaje y la infección. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 113, 2654–2659 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taylor, NM y cols. Estructura de la placa base T4 y su función en el desencadenamiento de la contracción de la vaina. Naturaleza 533, 346–352 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kostyuchenko, VA et al. Estructura tridimensional de la placa base del bacteriófago T4. Nat. Estructura. Biol. 10, 688–693 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Leiman PG, CP, Kostyuchenko, VA, Mesyanzhinov, VV y Rossmann, MG Reordenamiento tridimensional de proteínas en la cola del bacteriófago T4 tras la infección de su huésped. Celda 118, 403–404 (2004).

Artículo de Google Scholar

Cerritelli, ME, Wall, JS, Simon, MN, Conway, JF y Steven, AC Estequiometría y organización de dominio de la fibra larga de la cola del bacteriófago T4: una adhesina viral articulada. J. Mol. Biol. 260, 767–780 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hu, B., Margolin, W., Molineux, IJ y Liu, J. Remodelación estructural del bacteriófago T4 y las membranas del huésped durante el inicio de la infección. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 112, E4919–E4928 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Novaček, J. et al. Estructura y liberación del genoma del fago Myoviridae similar a Twort con una placa base de doble capa. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 113, 9351–9356 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shimamori, Y. et al. Aislamiento y caracterización de un nuevo fago SaGU1 que infecta aislados clínicos de Staphylococcus aureus de pacientes con dermatitis atópica. actual. Microbiol. 78, 1267–1276 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge, P. y col. Acción de una nanomáquina bactericida contráctil mínima. Naturaleza 580, 658–662 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge, P. y col. Estructuras atómicas de un nanotubo contráctil bactericida en sus estados de pre y poscontracción. Nat. Estructura. Mol. Biol. 22, 377–382 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desfosses, A. et al. Estructuras atómicas de un sistema completo de inyección contráctil tanto en estado extendido como contraído. Nat. Microbiol. 4, 1885–1894 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, F. y col. Estructura crio-EM y montaje de un sistema de inyección contráctil extracelular. Celda 177, e315 (2019).

Artículo de Google Scholar

Fraser, A. y col. Descripción cuantitativa de una máquina macromolecular contráctil. Ciencia. Adv. 7, https://doi.org/10.1126/sciadv.abf9601 (2021).

Taylor, NMI, van Raaij, MJ y Leiman, PG Sistemas de inyección contráctil de bacteriófagos y sistemas relacionados. Mol. Microbiol. 108, 6-15 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yang, F. y col. Estructura fina y patrón de ensamblaje de un miófago mínimo Pam3. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 120, e2213727120 (2023).

Ilca, SL et al. Reconstrucción localizada de subunidades a partir de imágenes de criomicroscopía electrónica de complejos macromoleculares. Nat. Comunitario. 6, 8843 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Duda, RL & Teschke, CM El sorprendente pliegue HK97: resultados versátiles con diferencias modestas. actual. Opinión. Virol. 36, 9-16 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caspar, DL & Klug, A. Principios físicos en la construcción de virus regulares. Puerto de primavera fría. Síntoma. Cuant. Biol. 27, 1-24 (1962).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Holm, L. & Rosenstrom, P. Servidor Dali: mapeo de conservación en 3D. Ácidos nucleicos res. 38, W545–549 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Z. y col. Estructura del sifovirus marino TW1: evolución de proteínas estabilizadoras de la cápside y puntas de la cola. Estructura 26, e233 (2018).

Artículo de Google Scholar

Dedeo, CL, Teschke, CM y Alexandrescu, AT Manteniéndolo unido: estructuras, funciones y aplicaciones de proteínas de decoración viral. Virus 12, https://doi.org/10.3390/v12101163 (2020).

Stone, NP, Demo, G., Agnello, E. y Kelch, BA Principios para mejorar la capacidad y la estabilidad de la cápside de un virus a partir de una estructura de cápside de virus termófila. Nat. Comunitario. 10, 4471 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, J. y col. Mirando hacia abajo por el cañón de un portal de bacteriófago: el empaque del genoma y la válvula de liberación en p22. Estructura 19, 496–502 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olia, AS, Prevelige, PE Jr., Johnson, JE y Cingolani, G. Estructura tridimensional de un vértice del portal de entrega del genoma viral. Nat. Estructura. Mol. Biol. 18, 597–603 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lokareddy, RK y cols. La proteína portal funciona de manera similar a un sensor de ADN que acopla el empaquetado del genoma con la maduración de la cápside icosaédrica. Nat. Comunitario. 8, 14310 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, F. y col. Estructura crio-EM de alta resolución de la máquina de entrega del genoma Sf6 del virus Shigella. Ciencia. Adv. 8, eadc9641 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sol, L. et al. Estructura crio-EM del ensamblaje de la proteína portal del bacteriófago T4 con resolución casi atómica. Nat. Comunitario. 6, 7548 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Olia, AS et al. Estabilización y ensamblaje inducidos por la unión del factor accesorio gp4 de la cola del fago P22. J. Mol. Biol. 363, 558–576 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pell, LG y cols. La estructura cristalina de rayos X de la proteína terminadora de la cola del fago lambda revela la estructura del anillo hexámero biológicamente relevante y demuestra un mecanismo conservado de terminación de la cola entre diversos fagos de cola larga. J. Mol. Biol. 389, 938–951 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Aksyuk, AA y cols. La estructura de la vaina de la cola del bacteriófago T4: una máquina molecular para infectar bacterias. EMBO J. 28, 821–829 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hardy, JM, Dunstan, RA, Lithgow, T. y Coulibaly, F. Colas altas: microscopía crioelectrónica de conductos de expulsión de ADN de cola de fago. Bioquímica. Soc. Trans. 50, 459–422W (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zinke, M. y col. Arquitectura del tubo de cola flexible del bacteriófago SPP1. Nat. Comunitario. 11, 5759 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zinke, M., Schroder, GF y Lange, A. Principales proteínas de la cola de bacteriófagos del orden Caudovirales. J. Biol. Química. 298, 101472 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Skolnick, J., Gao, M., Zhou, H. & Singh, S. AlphaFold 2: por qué funciona y sus implicaciones para comprender las relaciones entre la secuencia, estructura y función de las proteínas. J. química. inf. Modelo 61, 4827–4831 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olia, AS, Casjens, S. y Cingolani, G. Estructura de la aguja que penetra la envoltura celular del fago P22. Nat. Estructura. Mol. Biol. 14, 1221-1226 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hampton, HG, Watson, BNJ y Fineran, PC La carrera armamentista entre las bacterias y sus enemigos fagos. Naturaleza 577, 327–336 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bertozzi Silva, J., Storms, Z. y Sauvageau, D. Receptores del huésped para la adsorción de bacteriófagos. Microbiol FEMS. Letón. 363, https://doi.org/10.1093/femsle/fnw002 (2016).

Rakhuba, DV, Kolomiets, EI, Dey, ES y Novik, GI Receptores de bacteriófagos, mecanismos de adsorción de fagos y penetración en la célula huésped. Pol. J. Microbiol. 59, 145-155 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Salazar, AJ, Sherekar, M., Tsai, J. y Sacchettini, JC La estructura de la fibra de la cola de piocina R revela un dominio de unión al receptor con un pliegue de lectina. MÁS UNO 14, e0211432 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Henrissat, B. y col. Maquinaria catalítica conservada y predicción de un pliegue común para varias familias de glicosilhidrolasas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 92, 7090–7094 (1995).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Svoboda, E. Los virus que se alimentan de bacterias podrían proporcionar una ruta hacia la estabilidad en la fibrosis quística. Naturaleza 583, T8 – S9 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dedrick, RM y cols. Bacteriófagos diseñados para el tratamiento de un paciente con Mycobacterium abscessus diseminado resistente a los medicamentos. Nat. Medicina. 25, 730–733 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hernando-Perez, M., Lambert, S., Nakatani-Webster, E., Catalano, CE y de Pablo, PJ Las proteínas cementantes proporcionan estabilización mecánica adicional a las jaulas virales. Nat. Comunitario. Rev. 5, 4520 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Abrescia, NG, Bamford, DH, Grimes, JM y Stuart, DI La estructura unifica el universo viral. Año. Rev. Bioquímica. 81, 795–822 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Swanson, NA, Hou, CD y Cingolani, G. Proteínas de eyección viral: gimnastas conformacionales conservadas en mosaico. Microorganismos 10, https://doi.org/10.3390/microorganisms10030504 (2022).

Swanson, NA y cols. Estructura crio-EM del túnel periplásmico del eyectosoma de ADN T7 con una resolución de 2,7 A. Mol. Celda 81, e3147 (2021).

Artículo de Google Scholar

Stover, CK y cols. Secuencia completa del genoma de Pseudomonas aeruginosa PAO1, un patógeno oportunista. Naturaleza 406, 959–964 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Norte, OI et al. Las proteínas de ensamblaje de fibras de la cola de fagos emplean una estructura modular para impulsar el plegamiento correcto de diversas fibras. Nat. Microbiol. 4, 1645-1653 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dean, CR y cols. Caracterización del locus del antígeno O del serogrupo O11 de Pseudomonas aeruginosa PA103. J. Bacteriol. 181, 4275–4284 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Latino, L., Caroff, M. y Pourcel, C. Análisis de estructura fina de lipopolisacáridos en mutantes PAO1 de Pseudomonas aeruginosa resistentes a bacteriófagos. Microbiología 163, 848–855 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zheng, SQ y cols. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por el haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: Estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Conesa Mingo, P. et al. Herramientas web Scipion: procesamiento de imágenes crio-EM fácil de usar a través de la web. Ciencia de las proteínas. 27, 269–275 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pettersen, EF y cols. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Computación. Química. 25, 1605-1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Scheres, SH RELION: implementación de un enfoque bayesiano para la determinación de la estructura crio-EM. J. Estructura. Biol. 180, 519–530 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. y col. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. eLife 7, https://doi.org/10.7554/eLife.42166 (2018).

Terwilliger, TC, Sobolev, OV, Afonine, PV & Adams, PD Definición automatizada de mapas mediante la maximización del detalle y la conectividad. Acta Crystallogr. Estructura D. Biol. 74, 545–559 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goddard, TD y cols. UCSF ChimeraX: enfrentando los desafíos modernos en visualización y análisis. Ciencia de las proteínas. 27, 14-25 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. y Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D Biol. Cristalogr. 60, 2126-2132 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

Afonine, PV et al. Refinamiento del espacio real en PHENIX para crio-EM y cristalografía. Acta Crystallogr. Estructura D. Biol. 74, 531–544 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, IW y cols. MolProbity: contactos de todos los átomos y validación de estructuras para proteínas y ácidos nucleicos. Ácidos nucleicos res. 35, W375–383 (2007).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

DeLano, WL El sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 1.8 (Schrödinger, LLC. 2002).

Krissinel, E. Detección basada en stock de estados oligoméricos de proteínas en jsPISA. Ácidos nucleicos res. 43, W314–W319 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Laskowski, RA, Jabłońska, J., Pravda, L., Vařekova, RS & Thornton, JM PDBsum: resúmenes estructurales de las entradas del PDB. Ciencia de las proteínas. 27, 129-134 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Letunic, I. & Bork, P. 20 años del recurso de anotación de dominios de proteínas SMART. Ácidos nucleicos res. 46, D493–D496 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Poon, KK, Westman, EL, Vinogradov, E., Jin, S. & Lam, JS Caracterización funcional de MigA y WapR: ramnosiltransferasas putativas involucradas en la biosíntesis de oligosacáridos del núcleo externo de Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 190, 1857–1865 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos al personal de NCEF y NCCAT por su ayuda en la recopilación de datos crio-EM. Agradecemos a Drake Schaefer de la Universidad Thomas Jefferson por su apoyo en la impresión 3D. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01 GM100888, R35 GM140733 y S10 OD030457 a GC, y por la Fondazione per la ricerca sulla Fibrosi cistica-Associazione Trentina Fibrosi Cistica ODV In ricordo di Pio Nicolini subvención FFC#15/2021 a FB Research en esta publicación incluye el trabajo realizado en el Centro de Interacción Molecular y Cristalografía de Rayos X del Centro Oncológico Sidney Kimmel de la Universidad Thomas Jefferson, que cuenta con el apoyo parcial de la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico del Instituto Nacional del Cáncer P30 CA56036. Una parte de este trabajo se llevó a cabo en NCEF (con el apoyo del contrato 75N91019D00024); NCCAT y el Centro de Microscopía Electrónica Simons, con el apoyo de subvenciones de NIH (U24 GM129539), Fundación Simons (SF349247) y Asamblea del Estado de Nueva York.

Estos autores contribuyeron igualmente: Fenglin Li, Chun-Feng David Hou.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Thomas Jefferson, 1020 Locust Street, Filadelfia, PA, 19107, EE. UU.

Fenglin Li, Chun-Feng David Hou, Ravi K. Lokareddy, Ruoyu Yang y Gino Cingolani

Departamento de Biociencias, Universidad de Milán, Milán, Italia

Francesca Forti y Federica Briani

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FL, C.-FDH, RKL, RY y GC realizaron todos los pasos del análisis estructural y crio-EM, la deposición de coordenadas y mapas atómicos y la preparación de figuras. FF y FB purificaron el virión E217 y completaron la identificación del ensayo del receptor del huésped. GC y FB supervisaron el proyecto y escribieron el artículo. Todos los autores contribuyeron a la redacción y edición del manuscrito.

Correspondencia a Federica Briani o Gino Cingolani.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Alfred Antson y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Li, F., Hou, CF.D., Lokareddy, RK et al. Estructura crio-EM de alta resolución del bacteriófago Pseudomonas E217. Nat Comuna 14, 4052 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39756-z

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Recibido: 05 de febrero de 2023

Aceptado: 27 de junio de 2023

Publicado: 08 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39756-z

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